肿瘤靶向肽筛选

肿瘤靶向肽数据库

肿瘤靶向肽既有来源于抗体CDRs的类型、模拟抗体和受体相互作用的类型，也有基于配体(EGFR、激素受体、整合素受体等)的肿瘤靶向肽。

Kapoor等构建了一个基于肿瘤靶向肽的数据库TumorHoPe，其网址为 http://crdd.osdd.net/raghava/tumorhope/。这个数据库中的多肽可以特异性识别肿瘤细胞和肿 瘤相关的微环境(如新生血管)。网站中的信息来源于已发表的论文、专利和数据库。 TumorHoPe的当前版本包含744条肽。每个条目提供了肽的综合信息，如序列、靶向的肿瘤、靶向的细胞、鉴定技术、肽受体等。此外，该网站还收录了由肽的序列衍生出的其他各种信息，如肽的二级和三级结构、氨基酸成分、肽的物理化学性质。此数据库包含针对多种肿瘤的靶向肽，包括乳腺癌、肺癌、前列腺癌、黑色素瘤、结肠癌等;部分肽类具有一些共同的基序，如特异性识别肿瘤血管的RGD和NGR基序。TumorHoPe已经集成了诸如搜索功能、数据库浏览和肽绘图等许多基于Web的工具。这些工具允许用户基于氨基酸序列、电荷性、极性、疏水性来搜索肿瘤靶向肽(图5-1) 。

噬菌体展示技术

噬菌体展示技术是一项特殊的基因重组表达技术，亦是一种强大的筛选技术，指将外源蛋白分子或多肽的基因克隆到丝状噬菌体基因组中，与噬菌体外膜蛋白融合表达，然后展示在噬菌体颗粒的表面。由于外源蛋白或多肽的基因型和表型统一在同一噬菌体颗粒内，因此，通过表型筛选就可以获得它的编码基因。

1990年，Scott等在噬菌体展示技术的基础上发展并构建了噬菌体展示随机肽库。噬菌体肽库技术是一种新兴的药物发现工具，通过噬菌体展示随机肽库筛选获得的肽可以作为子载体运载药物，起到生物导弹的功能。筛选的肽也可以直接与药物靶点分子特异性结合，起到生物治疗的作用。近年来，噬菌体肽库技术已广泛应用于筛选肿瘤靶向短肽的研究中。

常用于噬菌体展示技术的噬菌体有两种类型：M1线性噬菌体和T7噬菌体。噬菌体展示库是把随机短肽片段与噬菌体P3或基因的N端进行融合，通过展示技术让随机短肽得以独立表达并具有生物学功能。噬菌体肽库构建的关键环节是得到足够多的能独立表达多肽的单克隆噬菌体，以便于靶标的结合与识别。筛选的结果受多个因素的影响，而合理地应用筛选方法是能得到高特异性、高亲和力多肽的最重要的环节。

噬菌体展示文库由数十亿条肽组成，它可以在体内鉴定组织的特异性从而研究疾病的特异性差异。将噬菌体展示文库注射到小鼠体内，进入血液循环，表达有组织靶向肽的噬菌体会结合在靶组织上，然后从靶组织中提取噬菌体并通过感染合适的细菌宿主来进行扩增;将整个过程重复几次以富集对靶组织具有高亲和力的表达肿瘤靶向肽的特异性噬菌体(图5-2)。此方法可以用于鉴定各种组织类型表达的分子标签、目前采用该技术已经筛选到多种靶向特定组织(包括正常和癌性组织)的多肽。因为需要在多轮重复淘选中富集到有活性的噬菌体，该噬菌体展示图谱的筛选可能相当费时。

合成肽库

合成肽库(synthetic peptide librarie, SPL)的方法也可以用于筛选及鉴定耙向肽。SPL方法允许筛选含有天然和非天然氨基酸的多种肽。它通过由含有4~10个氨基酸的短肽组成，这对于有效地选择性传递送药物最为适宜。通过分裂和混合方法能够合成出数十万数百万的肽。

SPL是直接以氨基酸为原料，将其偶联于某些载体或者是游离于溶液中的小肽的集合。根据最终的存在状态将其分为固相SPL和液相肽库，固相SPL的载体可以选择聚苯乙烯珠、棉花、滤纸和聚乙二醇等。

mRNA展示技术

2012年Nature Communication 杂志上报道了采用mRNA展示技术筛选肿瘤穿透肽的方法。现以此文献为例，做简单介绍，如图5-3所示。在体外将DNA文库转录成RNA文序，把RNA的3'端和带有嘌呤霉素的连接子结合使之与 RNA文库在无细胞翻译体系中共翻译，随后可以得到一个含有嘌呤霉素锚定的随机化肽-mRNA-cDNA嵌合分子文库。将Jurkat、CHO成HeLa等肿瘤细胞与该展示文库溶液的培养基共孵育1小时。采用ELISA、磁珠法等，分离含有目标肽的肽-mRNA-cDNA嵌合分子，洗脱后加酶分解到cDNA，将其进行PCR，得到产物进入下一轮循环，经过多次循环，目标肽及其编码的基因序列最终得到富集和分离，部分氨基酸序列被鉴定为CPP的主要候选物。将得到的具有15个氨基酸的长度的CPP 与异硫氰酸荧光素(FITC)结合，采用Jurkat、CHO和HeLa细胞验证肽的功能。基于该项研究，作者通过尝试不同细胞起源的恶性肿瘤系，筛选和鉴定了 47条具有对人肿瘤免疫治疗细胞具有独特穿透性的CPP。

软件模拟

Sharma等利用TumorHPD网络服务器分析了大量的肿瘤靶向肽和非肿瘤靶向肽的数据，在初步分析这些数据时，研究者观察到某些残基存在于肿瘤靶向肽中的比例高于其他残基，并且在特定位置存在“优选氨基酸”如C、R、G、W、P、L和S在TTP中更丰富。为了理解N末端和C末端残基的偏好，研寿考们计算并比较了 TTP和非TTP的 N-末端和C-末端残基的氨基酸组成(AAC)百分比。然而，在末端残基中没有发现氨基酸组成的任何显著性差异。另外在特定位置,存在某些优选残基，如在N末端第一位置的 C、A、S、G;在N末端第二位置的G、R、P、E等。类似地，在C末端P、R、C、N和 S等是优选残基。

基于这些观察，研究者开发了软件来区分肿瘤靶向肽和非肿瘤靶向肽的模型，并已经开发使用了氨基酸组成(AAC),二肽组成(DPC)和二元图谱(BPP)等SVM模型。由于二元图谱法含有关于氨基酸顺序及氨基酸出现频率的信息，该方法在判断肿瘤靶向肽方面相比于其他方法而言更具优势。基于上述方法，研究者已经开发了 TumorHPD在线服务， 网址为：http://crddosdd.net/raghava/tumorhpd/，TumorHPD 是用于预测肿瘤耙向肽的第一 种计算机模拟方法。

另外有一套依据著名的热点理论实现的靶向肽设计方法，其仅需要支架片段文库和一些关键的锚定残基就可以设计靶向多种蛋白的肽配体。

以hPD-1为例介绍该靶向肽的设计方法。关键锚点hPD-L1 [蛋白质数据库(PDB)代 码：4ZQK]的残基为 Y56、R113、A121、D122 和 Y123,这五个残基对 hPD-L1 与 hPD-1 的结合具有很大的影响。支架片段文库由109 805个螺旋和123 230个链片段组成。受到五个锚的位置和支架片段的结构特征的限制，研究者从支架文库中选择31个链和56个螺旋以承载锚A121、D122、Y123、Y56和R113的组合，形成513对支架对。513对支架对随后被重塑和精制为连续肽，选择其中4个肽并化学合成用于后续的生化验证。用基于SPR的方法检测肽和hPD-1的结合亲和力。四种肽的知值均不大于5umo1/L,最有效的 肽Ar5Y_4具有1.38±0.39umo1/L的KD值，表明这种方法能够设计出具有理想亲和力的肽配体。在四种肽中，肽Ar5Y_4具有最高结合亲和力，代表它是最有效的hPD-1结合肽。后续研究验证了肽Ar5Y_4是有希望的hPD-1抑制剂，并且有待进一步的优化。