基于体外筛选的抗体制备策略

分子展示技术又称为克隆展示技术，可以将基因型和表现型相互结合，通过将cDNA、寡聚核苷酸或基因组中的基因克隆再特定的表达载体中，使外源肽或蛋白质的结构域以融合表达的形式展示在表达载体的表面，被展示的多肽或蛋白质可以保持相对独立的空间结构和生物活性。依赖于细胞的展示技术有噬菌体展示技术、细胞表面展示技术、质粒展示技术，其由于要经历细胞转染过程，受到细菌转化效率、包装、跨膜分泌、降解等因素的影响，会导致筛选效率的降低。非细胞依赖的分子展示技术有核糖体展示技术、mRNA和 DNA展示技术等，其不受细胞转染限制，能显著增加库容量及分子多样性，具有很好的应用前景。

噬菌体展示抗体库技术

1985年，Smith通过基因工程技术首次将外源性的DNA片段与丝状噬菌体PIII基因融合，通过转录、翻译使得外源性基因编码的多肽与噬菌体衣壳蛋白形成融合蛋白后表达在子代噬菌体表面，从而初步建立了噬菌体展示技术，该技术兼顾基因型与表现型，将重组蛋甶质筛选与基因筛选合二为一。1989年英国医学家Winter与Leme首次采用PCR方 法克隆出人体的全部抗体基因，并重组于原核细胞表达的载体中;1990年Mccafferty 等通过运用该技术结合噬菌体展示技术，成功将抗体的可变区基因在魄菌体表面表达出来，进而构建了噬菌体抗体库。噬菌体抗体库可以高通量筛选各种抗原，可以快速获得易于改造的各种抗体片段。与杂交瘤技术相似，噬菌体抗体展示库技术也是种可以用来高效的生产单克隆抗体的技术，且兼顾了抗体的人源化，在医学研究和临床诊断和治疗中得到了广泛的应用。

噬菌体是一种基因数目少、结构相对简毕、易于操作的以细菌为宿主的病毒，其自身具有免疫原性，可作为佐剂样颗粒增强机体的免疫应答，同时具有对外界理化因素较强的适应力和抵抗力，具有较强的稳定性，适合用于大规模生产单克隆抗体。目前用于构建抗体库的噬菌体主要有丝状噬菌体、入噬菌体、T4噬菌体和T7噬菌休，其中含有完整的噬菌体基因组的丝状噬菌体最常用来构建肽库，丝状噬菌体展示技术主要与两种外壳蛋白有关，一种是主要外壳蛋白P8蛋白，另一种是次要外壳蛋白P3蛋白，这两种蛋白均可作为载体来展示外源多肽或蛋白，展示在噬菌体表面的外源性多肽或蛋白可保持相对独立的空间结构和生物学活性。

噬菌体抗体展示库技术的操作流程可概括为：将目标多肽或蛋白的编码基因或目的基因的片段插入到噬菌体衣壳蛋白结构基因的适当位置，表达形成外源多肽或蛋白与衣壳蛋白的融合蛋白，展示于子代噬菌体的表面。因为其具有相对独立的空间结构和生物活性，可以被靶向分子识别和结合，孵育一段时间后洗去未与靶分子结合或者弱结合的噬菌体，然后再用竞争性受体或者酸性洗脱剂洗脱强结合力的噬菌体，将其转染宿主细胞后繁殖扩增，经过3~5轮的吸附-洗脱-扩增循环后使得能与靶分子特异性结合的，表达特异多肽或蛋白的噬菌体得到高度的富集。然后对其进行DNA序列分析测定，从而实现经过富集、筛选得到表达目标抗体的单克隆噬菌体，同时可以筛选出目标特异性抗体的可变区基因。

目前，噬菌体展示库技术广泛应用于研究蛋白质之间的相互作用关系、酶的特异性及抑制剂、抗体工程和抗原筛选、受体结构和功能等领域的研究当中。该技术具有生产成本相对低廉、良好的免疫原性、较长时间内保持稳定存在、较好的特异性和敏感性等优点，另一方面也存在外源性多肽重叠、肽库容量限制性、密码子限制性等问题。噬菌体抗体库在临床研究和治疗中有重要的价值，通过噬菌体抗体库生产的多种单克隆抗体已经应用于临床中。例如，用于治疗类风湿关节炎的Adalimumab (商品名Humira)、治疗系统性红斑狼疮的Belimumab (商品名Benlysta)及抗肿瘤免疫治疗中使用的Ramucirumab (商品名Cyramza)等，但该技术仍面临怎样改良才能获得更加安全有效、高特异性、高亲和力、低免疫原性抗体的问题。

酵母展示技术

酵母是单细胞的真核生物，酵母展示技术的基本原理是将外源靶蛋白基因(外源蛋白)与特定的载体基因序列融合后导入酵母细胞，利用酵母细胞内蛋白转运到膜表面的机型与基因型一致和易于扩增的特性，可根据编码蛋白的特性对目的基因进行筛选，另外由于酵母细胞提交较大，可用荧光激活细胞分选仪进行筛选，该技术在展示高等哺乳动物蛋白天然构象方面有独特的优越性。

核糖体展示按术

核糖体展示技术是指通过加入启动子、核糖体结合位点、L〇〇p结构等，通过PCR 扩增目的基因的DNA，之后将置于具有偶联转录/翻译的无细胞培育，使目的基因的翻译产物展示在核糖体表面，形成“mRNA-核糖体-蛋白质”的三元复合物;利用常规的免疫学检测技术(如R1A、ELISA等)，通过固相化的靶分子直接筛选出含有目标蛋白的三元复合物，对筛选分离得到的复合物进行分解，释放出的mRNA后进行RT pCR;进行下一轮的富集和选择，最终筛选出髙亲和力的目标分子。目前己可通过该技术筛选出多种抗体。例如，血凝集素抗体、溶菌酶抗体、荧光素抗体、胰岛素抗体和黄体酮抗体等。由于不经过体内转化，可以构建出较大库容的抗体库，且可获得高特异性、高亲和力的抗体。

mRNA展示技术

mRNA展示技术是指通过化学合成方法合成编码多肽的DNA库，在其5'端添加T7 聚合酶启动子、翻译增强子、翻译起始密码子等序列，在3'端添加亲和纯化标签，之后在体外将DNA转录成RNA,把RNA的3'端和带有嘌呤霉素的连接子结合使之与RNA 文库在无细胞翻译体系中共翻译，mRNA与其所翻译的蛋白质结合起来形成mRNA-蛋白质融合体，可利用翻译蛋白所带的亲和标签，用亲和层析技术将mRNA-蛋白质融合体纯化出来，并对mRNA进行反转录，生成cDNA-mRNA-蛋白质融合体。采用EL1SA、磁珠法等，分离含有目标蛋白的cDNA-mRNA-蛋白质融合体，洗脱后加酶分解得到cDNA,将 其进行PCR，所得产物进入下一轮循环，经过多次循环，目标蛋白及其编码的基因序列最终得到富集和分离。mRNA展示技术主要应用于发现RNA、小分子、蛋白质等新的蛋白质配体和阐明蛋白质与药物在细胞中的相互作用机制，其他特殊运用包括介导蛋白质芯片的自我组装，利用非天然氨基酸和经化学修饰的肽构建文库，加速抗体体外亲和力成熟及进化等。