人源抗体库筛选

前述的抗体改造技术、分子展示技术构建出的人源化单克隆抗体要经过筛选才能大量获得。良好的筛选方法对于最大程度地富集到特异性好、亲和力高的新抗体有重要的意义。目前认为可通过构建大容量抗体库、严格筛选条件、优化筛选策略等方法来从抗体库中获得高亲和力抗体。以下以噬菌体抗体库的筛选为例进行说明，其筛选主要包括淘筛和鉴定两个步骤。淘筛是指将噬菌体抗体库与特定的抗原共同孵育，经过数论的洗脱后收集结合的噬菌体，将其用来感染细菌并扩增，之后再经过3~轮的吸附-洗脱-扩增循环，富集到于抗原特异性结合的噬菌体感染的多克隆菌株;鉴定是指将淘筛出的噬菌体感染细菌铺板后，从多克隆菌株中挑选出高特异性的单克隆菌株。筛选方法主要有固相或液相纯化抗原筛选法、全细胞筛选法、组织切片筛选法、体内筛选法，分别详述如下。

(1)固相或液相纯化抗原筛选法：是经典的、传统的纯化方法。固相筛选是指将抗原包被再固相介质上，如酶标板、试管、亲和层析柱等，然后加入待筛的抗体库，一段时间洗脱掉非亲和性的抗体，收集高亲和力的抗体，这种方法操作简单，但需要大量的纯化或重组抗原。液相筛选是指借助生物素、亲和素，在液相反应体系中提纯抗体，可以通过将抗原与生物素相连后固定在包被有链亲和素的顺磁珠上对噬菌体抗体库进行筛选，或者将生物素化的抗原先与噬菌体库相互作用，然后加入偶联有链亲和素的磁珠，富集能与抗原结合的噬菌体抗体。经典筛选技术的前提条件是目标抗体所靶向的抗原明确且能得到纯化品，对于抗原无法提纯、抗原性质不确定或经传统筛选会发生抗原失活者不适用。

(2)全细胞筛选法：指用完整的全细胞系来提纯抗体库，适合于抗原不能提纯、性质不明确(如肿瘤抗原)者，全细胞筛选要求目标抗原要有较高的表达水平，可以在筛选前先用不表达目标抗原的细胞进行孵育来初步提纯，细胞筛选受到非特异性大、背景值髙、洗涤过程中特异性配体损失等方面的影响，抗体的富集较慢，且多次筛选会很容易丢失稀有的特异性噬菌体抗体。目前，全细胞筛选主要的方法有：扣除筛选、炎光细胞分选法、磁性细胞分选法、内化筛选等。

(3)组织切片筛选法：Tordsson等使用转移性黑色素瘤的冰冻组织切片经固定、封闭后与噬菌体抗体库作用，经几轮吸附-洗脱-扩增循环后使特异的噬菌体抗体富集在切片上，此种方法可以原位结合到组织切片上，更适用于临床，但因为抗原量有限，富集的抗体量也较少。

(4)体内筛选法：由于有些活体细胞外培养难以存活或会发生膜变性，体外可以观察到的噬菌体抗体的特异性在体内可能不明显或者不存在，故体内筛选具有特殊的意义。有实验证明，这种筛选方法更适合于针对肿瘤血管内皮细胞上特异性标志物的抗体的分离筛选。