阐明成人T细胞白血病-淋巴瘤发展阶段的致癌分子机制

从HTLV-1感染到ATL的发展，细胞是如何分阶段变化的?

国家癌症中心研究所9月6日宣布，该所利用最新技术--单细胞多组学分析，阐明了人类T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)感染引起的成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)的多步骤致癌的分子机制。 这项研究是由该研究所分子肿瘤学系的高级研究员古谷淳史、志愿实习生斋藤由纪、庆应义塾大学医学院内科(血液学)系的教授片冈圭介(他还担任国家癌症中心分子肿瘤学部主任)和宫崎大学医学院血液学、糖尿病和内分泌学系的教授下田和也领导的研究小组进行的。 和京都大学医学院研究生院肿瘤生物学系的小川诚司教授。 该研究的结果已发表在《血癌发现》上。

成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)是一种造血肿瘤(血癌)，是由HTLV-1感染引起的CD4阳性T细胞肿瘤，在日本发病率很高。 主要的感染途径是在婴儿期通过母乳进行母婴传播。 近年来，由于彻底的健康指导，无症状携带者和ATL新病例的数量一直在减少。 近年来，由于健康指导和其他措施，无症状携带者的数量和ATL的新病例一直在减少。 然而，ATL仍然每年影响约700人，而且预后很差，除了造血干细胞移植外没有治愈性治疗。

HTLV-1感染后，病毒衍生的蛋白Tax会引起CD4阳性T细胞的永生化，但只有不到5%的HTLV-1携带者最终会发展为ATL，主要是通过免疫反应。 发展ATL需要很长的时间。 据推测，在这段漫长的时间里，不仅是HTLV-1感染的细胞，而且还有免疫细胞，主要是淋巴细胞，它们之前一直在监测和抑制HTLV-1感染细胞的增殖，发生了变化，导致存在异质性的细胞特征。

然而，迄今为止的研究技术只允许在不同类型的细胞混合物上进行全面的基因表达分析，并且只能确定数百至数万个细胞的异质群体的平均状态。 然而，最近的技术创新使得在单细胞水平上进行全面的基因表达分析成为可能，通过从含有多种细胞类型的临床样本中分离出单个细胞，从而评估细胞群的异质性和多样性。 研究小组利用单细胞多组学分析，即这种单细胞基因表达分析技术的进一步发展，来研究HTLV-1和ATL中感染细胞、肿瘤细胞和免疫细胞的异质性和多样性。

作为一种研究方法的 "单细胞多分子分析

单细胞多组学分析是一种最先进的研究方法，不仅能提供单个细胞的综合基因表达数据，还能提供100多个细胞表面标志物和T细胞/B细胞受体复合物的信息。

在常规的临床实践中，使用流式细胞仪分析细胞表面标志物，是对细胞类型进行分类的一个非常有用的工具，但直到现在，由于技术问题，每次只能对单个细胞的几个到20个细胞表面标志物进行检查。 在这项研究中，我们使用了针对每种标记物的抗体的寡核苷酸条码，然后可以在下一代测序仪上进行分析，这使得原则上可以同时测量超过几千个细胞表面标记物。 在血液学和免疫学中，细胞表面标志物已被用来对细胞类型进行分类以进行功能分析。 新方法是一个创新的实验系统，将积累的表面标志物信息与全面的单细胞基因表达分析结果直接联系起来。

它也非常有用，因为它允许我们结合T细胞和B细胞受体的重复。 要区分正常淋巴细胞、非肿瘤感染的淋巴细胞和肿瘤性ATL细胞是非常困难的，这一直是研究ATL发病机制的一个障碍。 现在，通过同时获得T细胞受体-肝脏信息，可以明确区分单克隆增殖的肿瘤细胞。

通过将这种单细胞分析与个别临床标本的基因畸变、患者的临床数据以及一系列功能实验相结合，研究人员能够提供HTLV-1感染和ATL发病机制的全面情况，提高对发病机制的理解，并确定新的治疗目标。

在单细胞水平上准确识别HTLV-1感染的细胞，实现了对细胞群的表达分析

首先，用4个健康捐赠者样本、11个无症状的HTLV-1感染携带者和34个ATL外周血单核细胞来分选有活力的细胞，然后用寡核苷酸标记102抗体，制备RNA样本进行单细胞分析，并使用新一代的 测序。 我们从总共49个样本中获得了233,093个细胞的综合基因表达、细胞表面标志物和T细胞/B细胞受体复合物的信息。

在综合基因表达数据的基础上，用统一的矩阵逼近和投影(UMAP)方法将聚类的结果绘制成二维图。 此外，有代表性的细胞表面标志物被用来划分每个细胞群属于哪种细胞类型，根据上述T细胞受体重复分析的结果，CD4阳性T细胞被分为肿瘤细胞和非肿瘤细胞。

然后提取非肿瘤CD4阳性T细胞，重新聚类并重新绘制在二维表面上，并与HTLV-1衍生的mRNA--HBZ的表达水平相叠加。 我们能够清楚地区分非感染性的幼稚和效应记忆CD4阳性T细胞和非肿瘤性的HTLV-1感染的CD4阳性细胞。 这项工作可以对非感染的正常CD4阳性T细胞、非肿瘤HTLV-1感染的CD4阳性细胞和肿瘤ATL细胞之间的基因表达进行比较分析。

分析显示，与未感染的幼稚和效应记忆CD4阳性T细胞相比，在非肿瘤HTLV-1感染的细胞中，一组对抗原呈现很重要的分子的表达明显上调。 对上调最多的mRNA分子LGALS1的功能分析显示，LGALS1的高表达使感染的细胞能够避免细胞毒性T细胞攻击诱发的凋亡。

细胞表面标志物表达分析确定CD99是一种分子，其表达随着从非HTLV-1感染的CD4阳性T细胞发展到HTLV-1感染的CD4阳性T细胞，然后发展到ATL而增加。 这可能是一个新的治疗目标。

HTLV-1感染细胞的克隆扩展程度可能是ATL进展的一个生物标志物

研究人员还关注了非肿瘤性HTLV-1感染的CD4阳性T细胞，并叠加了T细胞受体曲目。 他们发现，一些非肿瘤性HTLV-1感染的CD4阳性T细胞已经在克隆生长。 重要的是，在无症状携带者样本中，克隆增殖的程度与外周血单核细胞中HTLV-1感染的CD4阳性T细胞的比例成正比，表明这是一个潜在的ATL进展的生物标志物。

对非肿瘤性HTLV-1感染的CD4阳性细胞的基因表达分析，分为非克隆性感染细胞和克隆性增殖细胞，显示在感染期间上调的MHC II类分子在克隆性增殖感染的CD4阳性T细胞中下调，这表明逃避免疫系统有助于克隆性增殖。

HTLV-1感染和ATL进展过程中免疫微环境的变化

为了评估HTLV-1感染和ATL发展过程中的免疫微环境，我们比较了非肿瘤细胞中各血细胞部分的比例。 我们发现在HTLV-1和ATL中都观察到CD8阳性T细胞的减少，而B细胞的减少和骨髓细胞的增加则是ATL状态的特有现象。

还分析了肿瘤细胞的基因异常对免疫微环境的影响：20-30%的ATL病例有CD274的mRNA结构异常，CD274编码免疫检查点分子PD-L1，这些异常增加了ATL细胞中PD-L1的表达，有助于逃避免疫机制的影响。 这种基因异常已被证明可上调ATL细胞的PD-L1表达，有助于它们逃避免疫系统。 分析发现，肿瘤细胞的这种基因异常也会导致PD-L1在非肿瘤细胞如B细胞和骨髓细胞中的表达增加。

研究人员分析了Pd-l1在基因工程小鼠中的表达，这些小鼠专门模仿了CD4阳性T细胞中的Pd-l1 mRNA结构异常。 我们发现Pd-l1的表达不仅在CD4阳性T细胞中上调，而且在骨髓细胞中也上调，表明Pd-l1蛋白确实在体内转移到其他细胞。

转移到非肿瘤细胞的PD-L1也可能影响免疫微环境的变化

为了了解转移到非肿瘤细胞的PD-L1是否参与了ATL的发病机制，该研究小组进行了共培养实验。 首先，他们将永生化的HEK293T细胞与正常外周血单核细胞共同培养，并发现PD-L1确实被转移到了细胞中。 此外，当PD-L1转染的正常外周血单核细胞与活化的CD8阳性T细胞共同培养时，发现它们能抑制CD8阳性T细胞的增殖。

这项单细胞多组学分析还显示，在PD-L1失调的患者中，CD8阳性T细胞的比例减少，这表明不仅肿瘤细胞上PD-L1的高表达，而且转移到非肿瘤细胞上的PD-L1也可能影响免疫微环境的变化。

单细胞多组学分析有助于阐明以前在技术上不可能实现的致癌机制

这项研究是迄今为止对单一疾病进行的最大规模的单细胞多组学分析，全面展示了由HTLV-1感染引起的ATL的致癌分子机制，包括受感染的细胞、肿瘤细胞和免疫微环境。

正如这项研究所显示的，单细胞多组学分析在揭示致癌机制方面极为有用，而这些机制在技术上是不可能用常规分析方法找到的。 该研究小组说："我们将继续在单细胞多组学分析方面进行创新，并将该技术应用于临床实践，目的是进一步阐明全部致癌机制，并确定可能对疾病更有针对性、副作用更小的治疗目标。